Подесива контрола активности Цас12 промовише универзалну и брзу детекцију нуклеинске киселине у једном{1}}лонцу
Издавач: Универзитет науке и технологије Кине
Часопис: Натуре Цоммуницатионс
Фактор утицаја: 14.7
Користећи МИРА технологију, развијена је универзална-метода детекције флуоресцентне нуклеинске киселине (АНКЕТА) заснована на натријум хепарину. Студије су показале да натријум хепарин може да регулише активност цепања Цас12а ометајући процес везивања Цас12а-црРНА. Подешавањем концентрације натријум хепарина, СУРВЕИ је компатибилан и са класичним и са субоптималним ПАМ секвенцама и применљив је на више подтипова Цас12. Овај метод, са временом детекције од само 15-20 минута, постиже осетљивост и специфичност од преко 95% за откривање псеудовируса мајмунских богиња, вируса грипа А и САРС-ЦоВ-2. Ниска је-цена и обезбеђује нову методу откривања на месту неге за дијагностику на терену и праћење животне средине, решавајући тешку равнотежу између осетљивости и специфичности у традиционалној ЦРИСПР дијагностици.
1. Студија о механизму деловања хепарин натријума
Флуоресцентна сонда је додата Цас12а-црРНА систему који садржи 10 нМ циљне ДНК и примећен је брз и значајан флуоресцентни сигнал без додавања натријум хепарина. Када је додато 0,2 уг/мл натријум хепарина, флуоресцентни сигнал је био сличан оном у контролној групи, што указује да натријум хепарин у великој мери инхибира транс-активност цепања Цас12а. 0.2уг/мЛ натријум хепарина је минимална инхибиторна концентрација. Како се концентрација натријум хепарина повећава са 0,2 уг/мЛ на 0,5 уг/мЛ, цис{11}}активност цепања Цас12а се постепено инхибира, а при 0,5 уг/мЛ, активност транс{14}}цепања је скоро потпуно инхибирана. Студије о механизму деловања натријум хепарина су показале да негативно наелектрисане групе натријум хепарина ометају правилно везивање црРНК за Цас12а и могу утицати на формирање бинарног комплекса црРНАЦас12а.
- МИРА-Цас12а откривање једног{2} лонца
Након валидације механизма деловања натријум хепарина, рад је истраживао стратегију детекције у једном{0}у лонцу (МИРА-Цас12а), комбинујући МИРА амплификацију и детекцију флуоресценције посредоване Цас12а-у једној епрувети.
У одсуству натријум хепарина, комбинација МИРА-Цас12а није произвела значајан флуоресцентни сигнал у опсегу концентрације циљног гена од 0,1аМ до 10фМ. При 40µг/мЛ натријум хепарина, примећен је значајан сигнал флуоресценције у опсегу циљне концентрације од 1аМ (≈0,6 копија/μЛ, запремина=30μЛ) до 10фМ (≈6,000 копија/μЛ, запремина=30}-10 пута), што показује побољшање у односу на 0 пута у односу на секцију. систем без натријум хепарина.
Концентрација шаблона вируса мајмунских богиња била је 10 фМ, а Цас12а-црРНА (100 нМ) је коришћена за детекцију циљних гена ф31 и б6р. Реакција амплификације је завршена на 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16 и 20 минута, а садржај производа амплификације МИРА у различито време је анализиран на агарозним геловима. Добијени производи су затим анализирани на агарозним геловима под три различита подешавања: МИРА-хепарин натријум без Цас12а, МИРА-Цас12а без хепарин натријум и МИРА-Цас12а са хепарин натријумом. Резултати су показали да је у одсуству хепарин натријума амплификација нуклеинске киселине била отежана због високе цис{23}}активности цепања Цас12а. Међутим, додавање хепарин натријума значајно је повећало амплификацију нуклеинске киселине због смањења цис{27}активности цепања Цас12а.
У чланку се показује да се универзална метода детекције флуоресцентне нуклеинске киселине у једном{0}}лонцу (АНКЕТА) заснована на натријум хепарину може постићи коришћењем класичних ПАМ и субоптималних ПАМ секвенци. Поред тога, поред ЛбЦас12а, АсЦас12а и АапЦас12б се такође широко користе у ЦРИСПР-Дк методама. У систему који користи МИРА-АсЦас12а, флуоресценција је примећена само у присуству 40 уг/мЛ натријум хепарина, што указује да може да открије 1фМ гена ф31 и б6р. У недостатку натријум хепарина, МИРА-АапЦас12б може да открије 1 ген ф31 и б6р. Примена 20 уг/мЛ натријум хепарина не само да је убрзала стопу детекције МИРА-АапЦас12б, већ је и појачала интензитет флуоресценције. Ови налази указују на то да је метода једне{24}}оне посуде развијена коришћењем дозе натријум хепарина такође применљива на друге подтипове Цас12.
